Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Принцип метода проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

  • Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции при двух (и более) длинах волн и рассеивании света под углом в десять (так называемом малоугловом прямом рассеивании) и девяносто градусов. Приборы этого типа отличаются простотой использования.
  • Довольно громоздкие клеточные сортеры, способные измерить более пяти параметров исследуемых ядер или частиц, а также отсортировать клетки, обладающие определенным набором параметров.

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

  • Для проведения анализа на цитометре любого типа требуется гомогенная суспензия клеток определенного типа.
  • Не должно быть недостатка в количестве исследуемых клеток или их ядер.
  • Чтобы не допустить слипания клеток, исследователь должен обладать всей полнотой информации о характере рассеивания света и иметь под рукой таблицы с соответствующими данными.

Образцы

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

  • костного мозга;
  • крови;
  • спинномозговой жидкости (ликвора);
  • синовиальной (суставной) жидкости;
  • плевральной жидкости;
  • перитонеальной (асцитической) жидкости, накапливающейся в брюшной полости в процессе развития асцита;
  • опухолевых и здоровых тканей.

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

  • Используемый флуорохром должен быть специфичным по отношению к исследуемой ДНК.
  • Спектральные характеристики красителя должны соответствовать возможностям используемой аппаратуры.
  • Немаловажным фактором является стоимость флуорохрома (она не должна быть очень высокой).
  • Используемые красители должны быть удобны в работе (обладать стабильностью и хорошей растворимостью).

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

  • изотиоцианат флуоресцеина;
  • фикоэритрины (Су5, Су7, техасский красный);
  • аллофикоцианин;
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин.

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Преимущества

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

  • Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
  • Возможность определения клеточных субпопуляций.
  • Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
  • Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
  • Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

  • количественного анализа внутриклеточных структур (ДНК);
  • исследования основных параметров клеточного цикла;
  • идентификации и подсчета клеток, относящихся к разным периодам клеточного цикла;
  • обнаружения анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), свидетельствующих о развитии острого лейкоза;
  • выявления степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
  • обнаружения опухолевых маркеров;
  • наблюдения за состоянием пациентов, находящихся в группе риска;
  • оценки функционирования иммунной системы и функциональной состоятельности иммунных клеток;
  • выявления субпопуляций лимфоцитов (эта характеристика позволяет оценить состояние иммунитета).

о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

  • осуществить иммунофенотипирование (определить тип и функциональное состояние) клеток крови;
  • установить фагоцитарную активность иммунных клеток (об этом свидетельствует захват бактерий, помеченных флуоресцирующими красителями);
  • идентифицировать внутриклеточные белки;
  • определить степень пролиферативной активности;
  • исследовать стадии клеточного цикла;
  • оценить степень цитотоксичности (защитного механизма, позволяющего на внутриклеточном уровне уничтожать простейшие организмы, бактерии и вирусы) клеток.

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

  • безошибочно установить цитоморфологические характеристики любой клетки (ее размеры, уровень асимметричности, соотношение между ядром и цитоплазмой);
  • оценить активность ферментов, входящих в состав клетки;
  • проанализировать стадии клеточного цикла;
  • измерить физиологические внутриклеточные параметры (уровень pH, потенциал клеточной мембраны, концентрацию свободных ионов).

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

  • проанализировать субпопуляционный состав кровяных клеток;
  • подсчитать количество ретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
  • оценить последствия резидуальной (остаточной, не до конца излеченной) болезни;
  • диагностировать острый лейкоз;
  • выполнить дифференциальную диагностику реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней (недугов, при которых поражаются клетки, имеющие лимфоидную природу);
  • осуществить диагностику заболеваний лимфопролиферативной этиологии.

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

  • установить уровень экспрессии (чувствительности опухолей разных локализаций к лечению лекарственными препаратами) белковых маркеров;
  • измерить активность ферментов, входящих в состав клеток;
  • занимающимся изучением действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма, определить любую стадию клеточного цикла.

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

  • определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток;
  • произвести анализ любой стадии клеточного цикла;
  • выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.

Источник: http://gidmed.com/onkologiya/diagnostika-onk/protochnaya-tsitometriya.html

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Цитометрия поточная — это метод распознавания и подсчета единичных клеток, помеченных флюоресцирующими моноклональными антителами или внутриклеточными антигенами, ассоциированными с клеточным происхождением (например, Т-лимфоцитарное по сравнению с В-лимфоцитарным), клеточной функцией (наличие рецепторов цитокинов или других рецеп­торов), степенью зрелости (например, пре-В-клетки или зрелые В-клетки). Сегодня общий анализ крови делают методом проточной цитометрии.

Проточная цитометрия — метод исследования количества и качества клеток в ходе их перемещения через очень узкий капилляр.

Применение поточной цитометрии

Проточная цитометрия применяется для анализа образцов, включая перефирическую кровь, аспират костного мозга, с использованием основ­ных видов биопсии, в том числе тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ), биопсии свежей ткани и всех жидкостей организма.

Проточная цитометрия в диагностике, характеристике и мониторинге злокачественных новообразований:

  • Дифференциальная диагностика лейкемии миелоидной от лимфоидной при острой и малодифференцированной формах.
  • Диагностика иммунодефицитов путем иммунофенотипирования; прогноз.
  • Диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
  • Проточная цитометрия применяется в контроле за эффективностью терапии.
  • Определение минимальной резидуальной болезни в цереброспинальной жидкости или костном мозге.

Проточная цитометрия входит в алгоритм подсчета лимфоцитарных подтипов, например, CD4+ Т-клеток в качестве суррогатных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Использование анти-НbF-моноклональнх антител для определения HbF (можно определить менее 0,05% фетальных эритроцитов):

  • проточная цитометрия – более точный метод, чем мазок по Клейхауэру — Бетке для подсчета фетоматеринской кровопотери;
  • выявление увеличения доли эритроцитов, содержащих HbF (F-клетки), при гемоглобинопатии, у некоторых пациентов с миелодисплазией.

Проточная цитометрия применяется с целью:

  1. Диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии, миелодисплазии и системных мастоцитозов.
  2. Диагностика содержимого ДНК (анеуплоидия) и ДНК-синтезирующей активности опухолей (опре­деление степени злокачественности, например, при раке груди).
  3. Проточная цитометрия определяет показатель апоптоза.

  4. Определение мультилекарственной устойчивости в химиотерапии рака (например, устойчивость при чрезмерной экспрессии Р-гликопротеина и других белков).
  5. Определение перекрестной гистосовместимости для трансплантации органов и стволовых клеток (при трансплантации печени в том числе).

  6. Проточная цитометрия используется для определения числа CD34+ -клеток в периферической крови или трансплантате костного мозга, что коррелирует с успехом пересадки и длительностью гематопоэтического восстановления по­сле пересадки стволовых клеток.
  7. Для определения клеточносвязанных антител и сортировки субпопуляций в их составе.

  8. Подсчет ретикулоцитов (при анемиях, гиповитаминозах, для определения регенеративной актив­ности трансплантанта костного мозга). Также метод используют для определения индекса созре­вания ретикулоцитов и фракции юных ретикулоцитов (контроль анемий). Читайте о диагностике анемии в статье «Диагностика анемии. Какие анализы стоит сдавать?».

  9. Определение человеческого лейкоцитарного антигена В27 (HLA-B27).
  10. Определение антинейтрофильных антител, связанных с гранулоцитами или расположенных сво­бодно в плазме.
  11. Исследование функции нейтрофилов при иммунодефиците (например, фагоцитоз, кислородный взрыв, иммунофенотипирование) и хронической гранулематозной болезни.

  12. Митогенстимулированная оценка Т-клеток.

  13. Определение функциональной активности тромбоцитов, например, оценка состояния и размещения наружного рецептора в диагностике врожденных функциональных расстройств тромбоцитов (gpIIb/IIIa при тромбастении Гланцманна; gplb при болезни Бернара — Сулье), показатель тромбоцитассоциированного IgG при иммунной тромбоцитопении и др.

  14. Исследование выживаемости эритроцитов с использованием эритроцитов, меченных биотином вме­сто хрома-51.
  15. Выявление внутриклеточных паразитов (Babesia, Plasmodium, Trypanosoma) с использованием РНК- и ДНК-связанных флуорохромов, которые связывают паразитов.

В трансфузионной медицине проточная цитометрия используется для:

  • Определение и подсчет низкого уровня иммуноглобулинов, связанных с эритроцитами и не опре­деляемых прямым антиглобулиновым тестом (прямая проба Кумбса) у пациентов с гемолизом.
  • Определение эритроцитарного химеризма.
  • Точное фенотипирование эритроцитов после многочисленных трансфузий.
  • Перекрестное взаимодействие с тромбоцитами.
  • Определение комбинации лейкоцитов в продуктах крови.

Цитометрия применяется при трансплантации:

  • Трансплантация стволовых клеток: соответствие числа CD34 у доноров или реципиентов.
  • Определение аллоантител к HLA при трансплантации органов.

В микробиологии цитометрия применяется для:

  • выявления специфических антител;
  • определения присутствия гетерогенных популяций с разной чувствительностью к антибиотикам.

Метод проточной цитометрии не рекомендуется для диагностики Ходжкинской лимфомы, хронического миелобластного лейкоза или миелодиспластического синдрома, но может использоваться для мониторинга последних двух патологий.

Источник: http://pro-analizy.ru/protochnaja-citometrija/

Принцип

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку.

Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе.

В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:    – рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

   – рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

   – интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Применение

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний.

В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови.

При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

  • Иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • Определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
  • Определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
  • Определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • Определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
  • Исследование клеточного цикла
  • Оценка клеточной цитотоксичности
  • Определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • Оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • Определение экспрессии поверхностных антигенов
  • Анализ стадий клеточного цикла
  • Измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)
  • Измерение экспрессии маркеров
  • Измерение активности внутриклеточных ферментов
  • Определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне
  • Определение плоидности клеток
  • Анализ клеточного цикла
  • Анализ и сортировка протопластов

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов.

Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п.

, что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Источник: http://www.cytosense.ru/software

Биология

Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения
08 февраля 2011
Емкость 20 м3 резервуар горизонтальный стальной ргс 20.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы для проточной цитометрии

  • кровь
  • костный мозг
  • ликвор
  • суставная жидкость
  • плевральная жидкость
  • асцитическая жидкость
  • суспензированные клетки тканей

Принцип метода

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

  • рассеяние света под малыми углами.
  • рассеяние света под углом 90°.
  • интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Наиболее часто используемые флуорохромы

  • Флуоресцеина изотиоцианат
  • Фикоэритрин
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин
  • Алофикоцианин

Тандемные красители:

  • Фикоэритрин — Техасский красный
  • Фикоэритрин — Cy5
  • Фикоэритрин — Cy7
  • Аллофикоцианин- Cy7

“Квантовые точки” QD560, QD590 и т.д.

Преимущества метода

  • короткое время анализа за счет высокой скорости
  • анализ большого количества клеток
  • логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
  • измерение параметров редко встречающихся клеток
  • объективное измерение интенсивности флуоресценции

Иммунология

  • иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • определение фагоцитарной активности
  • определение внутриклеточных цитокинов
  • определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • определение пролиферативной активности
  • исследование клеточного цикла
  • оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

  • количественный анализ внутриклеточных компонентов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • выявление анеуплоидного клона
  • определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
  • определение специфических маркеров
  • позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
  • оценка состояния иммунной системы:
  • оценка клеточного звена иммунитета
  • оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток

Цитология

  • определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • определение экспрессии поверхностных антигенов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • измерение физиологических параметров клетки

Гематология

  • анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
  • подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
  • дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
  • диагностика лимфопролиферативных заболеваний
  • диагностика острых лейкозов
  • оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

  • измерение экспрессии маркеров
  • измерение активности внутриклеточных ферментов
  • определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах, определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний.

В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови.

При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов.

Подвергнутые воздействию антибиотиков микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п.

, что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

11036

Источник: http://www.muldyr.ru/a/a/protochnaya_tsitometriya

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.